| Resumen |
- Los mecanismos celulares que controlan la síntesis, ensamblaje y tráfico de los canales iónicos dependientes de voltaje aún no se conocen completamente. En un trabajo previo Naranjo y cols., encontraron que es posible separar el mensaje que codifica para cada una de las subunidades del canal de potasio tipo Shaker en dos partes llamadas N-part (Sha) y C-part (Ker) (datos no publicados). Estos fragmentos producen canales funcionales cuando sus RNA mensajeros son coinyectados en ovocitos de Xenopus. Los cuestionamientos que surgen de estos datos son: ¿cómo y dónde las secuencias truncadas se encuentran una a otra formando una subunidad funcional?. Para facilitar el seguimiento del canal de potasio, la proteína fluorescente verde (GFP) se fusionó al canal Shaker. Los constructos resultantes fueron: GFPShaker (donde la secuencia de la GFP se adicionó al extremo 5´), Shaker-GFP (correspondiendo al extremo 3´), y las mitades de la subunidad GFP-Sha y Ker-GFP. Células de la línea COS-1 en cultivo, fueron transfectadas transitoriamente para visualizar el tráfico de las subunidades del canal de potasio Shaker usando microscopía confocal. La fluorescencia de GFP-Shaker, Shaker-GFP y GFP-Sha se muestra heterogéneamente distribuída, sugiriendo la acumulación en compartimentos discretos. En adición, estas construcciones colocalizan con la Brefeldin A, la cual fue usada como un marcador para el sistema de Golgi. De manera contrastante, el patrón de fluorescencia producido por la GFP se observó homogéneamente distribuído a través del citoplasma. Ker- GFP fue el único constructo que produjo poca o nada de fluorescencia. Por otro lado, la inyección del DNA complementario de GFP-Shaker en ovocitos de Xenopus produjo corrientes características, sugiriendo que su acople con la GFP no afecta la función del canal. En base a estos resultados, inferimos que la fusión de proteínas GFP-Shaker, Shaker- GFP y GFP-Sha poseen los determinantes estructurales para su procesamiento y tráfico correcto del retículo endoplásmico al Golgi. La ausencia de fluorescencia en Ker-GFP podría indicar que carece del dominio estructural para el tránsito entre organelos. |
Tesis de posgrado